ペニシリン（その５）：ペニシリンの抽出

ペニシリンの抽出：
まずはじめは、培養液のろ過は使用済みのパラシュートの絹が利用された。
つぎに、低温で酸性化しエーテル（後にはアミルアセテート）と混合振蕩。
後者は低温室でおこなわれたが、その作業は大変であった。

ヒートレイはこれを改良して　"counter-flow exchange" と呼ばれる方法を用
いた。酸性化した培養ろ液を、長いチューブの上流からながす。下流から
エーテルを上流にむかって上昇させる。お互いの液面がこうして最大限に
接触する時間がゆくられる、そのあいだにペニシリンがエーテル層に移行。
エーテル層を集め、今度はそれを下流にながす、一方アルカリ水を上昇さ
せる。そしてアルカリ水を集め、"freeze-drying"する。この凍結乾燥法は、
1935年アメリカで開発されミルク、血漿、有機物資に応用された。液体窒
素かアセトンドライアイスで低温化した状態で真空にすると、水分は蒸発
し粉末状態になり長期保存にたえる。

1940年3月中旬にはチェンはこうして、ペニシリン100mgあつめた。
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Gwyn Macfarlane, Howard Florey- the making of a great scientist,
1980, Oxford University press. から翻訳。


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ペニシリン（その４）：ペニシリン活性の測定

ペニシリン活性の測定法：

最初の進歩はHeatleyがペニシリン活性の測定に、cylinder-plate法を発明したこ
とだ。これは今までの"well-plate"法より格段の進歩であった．培養プレートの
上にブドウ球菌を植えた後、短いグラスチューブを6〜8本さしこみ，そして
テストする溶液をチューブに入れ孵卵器で培養する。もしペニシリンを含ん
でいればシリンダーの周囲は菌の増殖は阻止される。その阻止された直径が
ペニシリン活性である。
------- Heatley NG, A method for the assay of penicillin. Biochem J.1944; 38(1): 61–65.

現在使用されている抗生物質感受性テスト：

抗生物質を含む円形のデスクをおいて細菌を培養すると

右のデスクの周囲は菌の発育が阻止されている。

1940年3月チェンとヒートレイはペニシリンの安定性、溶解性についてのpH
効果について議論した。ヒートレイは水が酸性ならペニシリンが水からエーテ
ルに移行するのではないか？と提案した。事実、酸性化したカビのろ過液と
エーテルを混合振蕩し、置くと２層に分離する。次にエーテル層をややアルカ
リにした水と振蕩すると、水の層にペニシリンが移行する。”back-extraction”と
呼ばれる方法である。
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Gwyn Macfarlane, Howard Florey- the making of a great scientist,
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休憩

ペニシリン（その３）：カビの培養

-------------　The Lancet, 238:177-188, August 16, 1941.

カビの培養：

ペニシリンをつくるカビは無菌状態のCzapek-Dox液の表面で成長する。数日で

黄色のゼラチン状の膜を形成し、緑色の芽胞をつくる。ペニシリンが含まれる

培養液は黄色になり10-12日で最大含有量となる。産生量を増やす方法をいろい

ろ試みられたが、いくつかを除いてほとんど失敗した。

１つはPaul Fildes がbrever's yeastを培養液に加えるとで産生量を増やさないが、

培養期間を1/3に短縮できることを見い出した。また10〜12日後に新しい培養液

にかえることで2回目の回収ができること。しかもこれは12回くりかえせるし、

産生量が減ることなくおこなえる。培養液の深さを1.5cmを超えないようにした

とき産生量が上昇する。

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ペニシリン（その２）：1938年オックスフォードでペニシリン研究開始

写真：チェイン博士（1906ー1979）

1938年　オックスフォード大学のチェイン博士は，これまでに発表された
微生物が産生する抗細菌物質に関する論文を200編あまりを収集。
その中に1928年発表されたフレミングのペニシリン論文を見つます。

”　フレミング博士の論文を読んですぐ大変興味をもった。そのカビの

分泌する物質ペニシリンはブドウ球菌を溶解する強い作用を有する。

フレミングはカビのリゾチームの１種を発見したと思った。卵の白身に

含まれるリゾチームと異なり広範囲のグラム陽性球菌に作用する。

これらの病原菌の細胞壁には，このカビの酵素が作用する共通の基質が

あり，それを精製分離する価値がある。まず最初にペニシリンを精製す

る必要がある。私にはリゾチームの研究経験から出来ると思った。”

フローリー教授とチェイン博士は有望な抗細菌物質候補としてBacillus subtilitis
とBacillus pyocyaneusの分泌する物質そしてペニシリンの３つを取り上げ研究
することにしました。翌年からは，ペニシリンに絞って教室の全力を注ぐように
なります。

しかしペニシリンはカビの培養条件により産生量が異なること，青カビが
ストレス状態におかれた時にペニシリンの産生能が高まったり，またペニシリン
分子が大変不安定で精製の途中で壊れ易いこと（ペニシリンは分子量が310から
350ぐらいしかない）などで，その分離精製は試行錯誤の連続でした。
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ペニシリン（その１）：1928年フレミング博士の発見

写真： ペニシリンを産生する青カビ, penicillium notatum,

（ Microbe Library; American Society for Microbiology，

から引用 →　http://www.microbelibrary.org/index.asp）

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アレキサンダー・フレミング博士のペニシリン発見とその後
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1928年のある日、ロンドンの聖メアリー病院のフレミング博士はブドウ球菌
の培養プレートの端に生えた青カビの周囲には菌のコロニーがないことを発
見しました。　

1929年，イギリス実験病理学雑誌にそのカビの培養液についての論文を発表。
Fleming A., On the antibacterial action of culture of a penicillium with special
reference to their use in the isolation of B. influenzae. British Journal of Experimental
Pathology. 10:226. 1929.

表題は　”ペニシリウム培養液の抗細菌作用ー特にインフルエンザ菌の分離に
使用することに関連して”----------この論文の中でカビの培養液の濾過液を
ペニシリンと命名。カビの種類はPenicilliumであり，Penicillium rubrumに
近い種類に属すると報告。


この論文でフレミングは、インフルエンザ菌の分離培養のためにペニシリン
を用いるとよいと書いた。そしてペニシリン感受性微生物に感染した表面殺
菌剤として効果あるかもしれないと短く言及した。


しかし，この後，フレミング博士は，このペニシリウム培養液の追求研究を
やめます。ペニシリンを分離精製すること，動物，ヒトの細菌感染症の治療
薬として利用することをしませんでした。
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参考）
Gwyn Macfarlane. Alexander Fleming: the Man and the Myth.Oxford University Press. 1985.

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日本脳炎ワクチンの全面再開

日本脳炎の発生している国

H１７年５月から日本脳炎ワクチン接種が一時中止されてきましたが，此のたび
５年ぶりに全面再開されました。３〜４才頃に接種すべきところを，さしひかえて
きた子供さんもーーーー ９才〜１３才未満の方：１期２回接種（１〜４週間あけて）
→１年後に追加ーーーーできるようになりました。


日本脳炎ワクチンの標準的な接種法（４回）
　①　３〜４才（６か月〜７才半未満）：２回接種（１〜４週間あけて）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　→１年後に追加。
　②　９〜１３才未満：１回接種


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